关键词:
输血治疗
冷冻保存
红细胞
冷冻保护剂
数学模型
摘要:
目的:输注红细胞是治疗缺血性贫血、应急性失血和白血病等疾病的有效治疗方案。通过常规方案,红细胞最多只能储存42天,这导致了大量红细胞失效弃用。在深低温下,红细胞的代谢速率会大大降低。因此,将红细胞置于液氮中冷冻保存是延长其有效期的有力方法。在冷冻的过程中,形成的冰晶会对红细胞造成不可逆转的伤害。目前,通常在红细胞冷冻前加入高浓度的甘油作为冷冻保护剂(Cryoprotectant,CPA),以此来降低损伤。然而,甘油会严重诱导红细胞形变和溶血,使得其冷冻保存效率大打折扣。基于上述挑战,我们希望找出一种无毒、安全、高效的CPA,从而推动红细胞冷冻保存的发展。方法:本研究以绵羊红细胞为实验模型,从甘氨酸(一种经典CPA)的衍生物出发,选择N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-tris(hydroxymethyl)methylglycine,Tricine)作为目标CPA。将Tricine与红细胞共培养,以红细胞存活率为指标验证其生物相容性。在梯度浓度的Tricine溶液中冷冻保存红细胞,确定其最佳使用浓度。从三种冷冻损伤(机械损伤,渗透损伤和氧化损伤)入手,探究Tricine在冷冻保存中的作用机理。用高浓度的Na Cl溶液来模拟红细胞在冷冻过程中经历的高渗状态,检测Tricine在调节渗透平衡中的作用。通过Splat assay检测Tricine的冰重结晶抑制(Ice Recrystallization Inhibition,IRI)活性,并用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry,DSC)检测Tricine中结合水比例,以此来验证其抵抗冰晶机械损伤的能力。通过DPPH法(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl assay)测定Tricine总抗氧化能力,并以冷冻保存后红细胞超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量为指标,检测Tricine抵抗氧化损伤的能力。以红细胞形态、红细胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate,ESR)、ATP酶活性和血红蛋白含量为指标,测定冷冻保存后红细胞的功能;最后,使用数学模型定量分析Tricine在冷冻保存中的优势。结果:Tricine与红细胞共同培养48h后,红细胞基本没有发生溶血,表明Tricine具有优秀的生物相容性;冷冻保存实验证明了Tricine能在低温下有效地保护红细胞,在最佳浓度下红细胞的存活率高达80%以上。渗透实验显示,在高浓度的Na Cl溶液中,红细胞会严重地渗透脱水,表现出荆棘型的外观以及低的存活率;而Tricine的加入大大缓解了红细胞的脱水和死亡,这表明在冷冻过程中Tricine可以有效地降低由溶剂结冰而导致的渗透损伤。Splat assay实验表明,Tricine具有很强的IRI活性,可以显著抑制复温过程中的冰晶生长,降低大尺寸冰晶对红细胞的机械损伤。DSC实验进一步表明,Tricine具有强大的结合水能力,可以打破水分子间的氢键网络,从而抑制冰重结晶。DPPH清除能力实验和SOD酶活性测试分别证明,Tricine既可以直接清除活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),也可以通过维持内源性抗氧化酶活性来抵御氧化损伤;冷冻后红细胞的MDA含量直接表明,Tricine可以减轻冷冻过程中脂质过氧化。在Tricine中冷冻后,红细胞形态、ESR、ATP酶活性和血红蛋白含量均与未冷冻的新鲜红细胞无显著差异,证明其具有正常的性质和功能。优劣解距离法(Technique for Order Preference by Similarity to Ideal Solution,TOPSIS)、层次分析法(Analytic Hierarchy Process,AHP)以及秩和比法(Rank Sum Ratio,RSR)三种数学模型用于对比Tricine与其他CPA。结果表明,Tricine在冷冻保存中具有优秀的性能。结论:Tricine具有优秀的生物相容性。在最佳浓度下,Tricine可以有效降低冷冻过程中红细胞受到的渗透损伤、机械损伤和氧化损伤,获得令人满意的存活率。此外,红细胞的性质和功能保持正常。通过数学建模分析进一步证明了Tricine在冷冻保存中的优越性能。此研究为红细胞冷冻保存和新型冷冻保护剂的研发提供了新的思路,有望促进输血医学的发展。图23幅,表17个,参考文献86篇