关键词：
过度训练
大鼠
急性肾损伤
发病机制
药物干预
摘要：
目的:过度训练是由于运动训练负荷过大,超过机体的承受能力,导致多器官功能紊乱的病理状态。近年来,过度训练引起脏器损伤的研究受到重视,但过度训练引起急性肾损伤(overtraining-induced acute kidney injury, OTIAKI)的研究工作不多,进展不大,有关OTIAKI的特征及其发病机制还不清楚。近年研究发现,肾组织细胞凋亡参与了运动性蛋白尿的发生,但肾组织细胞凋亡在OTIAKI中的作用及其发生的分子机制尚未阐明,对OTIAKI的防治在临床上尚缺乏有效的药物。中药唐古特莨菪提取物山莨菪碱具有解除血管痉挛、改善微循环的作用,对缺血性急性肾衰竭具有防治作用;从欧亚旋覆花提取的有效成分旋覆花素可通过抗炎信号转导途径影响细胞的凋亡;苦碟子的有效成分可通过清除自由基和抗氧化作用防治缺血再灌注损伤。这三种药物对各种原因引起的组织缺血、缺氧和细胞凋亡具有拮抗作用,但它们是否能防治OTIAKI及其防治OTIAKI的分子机制尚未见文献报道。本研究通过让大鼠游泳至力竭,建立大鼠过度训练致急性肾损伤模型,采用多种实验技术,分别检测各组大鼠肾功能及肾组织结构的改变以及肾组织细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化;从多层次研究了OTIAKI时肾损伤的病理特征及其发病机制,阐明肾损伤过程中肾细胞凋亡的诱发因素、基因调控及细胞内信号转导途径,观察山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子对OTIAKI的防治作用及其分子机制,加深对OTIAKI发病机制的认识,寻求新的治疗靶位点,为临床OTIAKI的防治提供新的理论依据和措施。
方法:将80只雄性Wistar大鼠(体重200～220g)随机分为安静对照组(control,CN,n=8)、力竭运动组(exhaustive swimming,ES,n=24)、山莨菪碱干预组(Anisodamine, AD,n=16)、旋覆花素干预组(Inula Britannica,IB,n=16)、苦碟子干预组(Ixeris Sonchifolia,IS,n=16)。CN组为安静对照;ES组又根据力竭后恢复时间分为力竭后即刻(ESI)、力竭后6h(ES 6h)和力竭后24h (ES 24h);AD组于力竭运动前20 min腹腔注射山莨菪碱10 mg/kg后进行力竭运动,分为AD 6h和AD 24h组;IB组于力竭运动前24h分三次口腔灌入旋覆花素25 ml/kg(含ABL65 mg/kg)后进行力竭运动,分为IB 6h和IB 24h组;IS组于力竭运动前20 min腹腔注射苦碟子注射液20 g/kg(含总黄酮8 mg/kg和腺苷0.05 mg/kg)后进行力竭运动,分为IS 6h和IS 24h组。每个时间点8只大鼠。采用大鼠游泳至力竭建立过度训练致急性肾损伤模型;用日立7170A全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(Cr)、尿素(Ur)、磷酸肌酸激酶(CK)及尿γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT);光镜及电镜观察各组大鼠肾组织结构的改变; TUNEL法及流式细胞术检测各组大鼠肾组织细胞凋亡;免疫组化法及流式细胞术检测各组大鼠肾组织NF-КB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9的变化;免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织TNF-α、Bax、Bcl-2、Bid及E-Cadherin蛋白的表达;黄嘌呤氧化酶法测定血清和肾组织中SOD的活力,用硫代巴比妥酸法测定血清和肾组织中MDA的含量。实验数据用均数±标准差(ˉx±s)表示,用SPSS 12.0软件包进行统计学分析,组间差异用单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义。
结果:
1过度训练致大鼠急性肾损伤的结构特征及炎症细胞因子和NF-КB的作用
为了了解过度训练致OTIAKI的损伤特征,本部分实验观察了过度训练大鼠肾脏功能、形态及代谢的变化。结果表明,力竭后即刻大鼠血清Ur、Cr、CK即明显升高,6h达高峰,24h恢复到对照水平;于力竭后6h尿γ-GT也明显升高,力竭后24h尿γ-GT升高更为明显。光镜观察发现,力竭后即刻和力竭后6h大鼠肾组织结构变化轻微,力竭后24h可见肾小管上皮细胞刷状缘不规整,部分脱落,在皮髓质交界处及髓质可见大量细胞的细胞核深染,有固缩现象。电镜观察发现,力竭即刻大鼠肾小球滤过膜足突融合,近曲小管微绒毛排列稍紊乱,上皮细胞质明显水肿,线粒体大部或全部嵴和膜融合或消失,核染色质浓缩,电子密度增高并边集于核膜下,提示有早期细胞凋亡现象;力竭后6h及24h上述变化加重。TUNEL法及流式细胞术检测显示,力竭后即刻、6h、24h肾组织细胞凋亡率呈进行性增高,各时间点均明显高于CN组(P<0.05);各组尿γ-GT与肾细胞凋亡率呈明显的正相关(γ=0.98,P<0.01)。上述结果说明过
