关键词:
植物化学物
抗肠道炎症
FTO蛋白
m6A修饰
mRNA稳定性
摘要:
炎症性肠病(IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,控制肠道炎症过程是改善IBD的有利手段之一。研究表明,N6-腺苷酸甲基化(m6A)水平异常升高是引起炎症的重要诱因,脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)作为m6A的去甲基化酶,能够去除m6A的甲基化,作为抗炎潜在的新靶点。大量文献证明了许多植物化学物具有抗炎活性,课题组前期从植物化学物库中筛选出在结构上、化学环境中及细胞内均与FTO活性位点结合良好的三种不同结构的植物化学物(紫花前胡素、木犀草素、高丽槐素),具备靶向FTO的潜力,然而这三种化合物抗肠道炎症的作用以及靶向FTO抗炎的作用机制还不清楚。研究植物化学物新的抗炎靶标有利于各炎症相关疾病机制的探究,对开发防治IBD等慢性炎症相关疾病新的治疗方案有着重要意义。
本文以潜在的以FTO为靶点的三种植物化学物(紫花前胡素、木犀草素、高丽槐素)作为研究对象。在细胞水平和动物水平上分别采用TNF-α和DSS诱导构建Caco-2细胞炎症损伤模型和小鼠结肠炎模型,探究以上三种植物化学物抗肠道炎症的作用。然后在细胞和动物活体水平上,通过LC-MS/MS和免疫组化对m6A水平进行定量,探究三种植物化学物对m6A水平的影响,并分析m6A水平与肠道炎症的相关性。在细胞水平上抑制FTO活性,探究FTO/m6A是否介导以上三种植物化学物的抗炎作用。最后,对三种化合物是否直接活化FTO,介导下游靶mRNA的m6A修饰发挥抗炎的分子机制进行研究。主要研究结果如下:
1、采用20 ng/m L的TNF-α作用Caco-2细胞12 h,成功建立了细胞炎症损伤模型,表现为炎症因子IL-6、ICAM基因/蛋白表达显著增加。在此基础上发现低水平(10μM)的紫花前胡素、高丽槐素、木犀草素均能有效改善细胞炎症,下调IL-6、ICAM基因/蛋白水平。另外,在动物活体水平上使用3%的DSS构建了小鼠结肠炎模型,研究以上三种植物化学物的体内抗炎效果。结果表明,三种化合物都能有效缓解小鼠结肠炎症状,表现为减少小鼠的体重减轻和DAI评分,减轻小鼠结肠的病理损伤程度,明显抑制小鼠结肠的缩短(紫花前胡素:4.84±0.39 cm至5.96±0.25 cm;高丽槐素:4.84±0.39 cm至5.60±0.32 cm;木犀草素:4.84±0.39 cm至5.32±0.23 cm),显著下调炎症因子IL-6、IL-1β、IL-18、VCAM的基因/蛋白水平,促进紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达,保护结肠屏障的完整性。
2、利用LC-MS/MS和免疫组化衡量Caco-2细胞和小鼠结肠组织中m6A水平的变化,发现模型组炎症水平的升高伴随着m6A水平的异常升高,紫花前胡素、木犀草素、高丽槐素显著降低细胞和结肠组织中的m6A水平。随后对结肠组织中的m6A水平与炎症水平进行了相关性分析,结果表明,这三种植物化学物的抗炎作用与m6A水平的降低密切相关,m6A水平与炎症水平呈正调控关系,其中紫花前胡素表现出更好的效果。而在细胞水平上抑制FTO活性,发现这三种植物化学物降低m6A水平以及抗炎的作用均被显著逆转,表明这三种化合物靶向FTO,介导m6A修饰抗炎。
3、利用m6A笼状DNAzyme酶法确定了紫花前胡素、高丽槐素、木犀草素直接激活细胞内FTO活性。然后,利用m6A位点预测软件SRAMP对IL-6和ICAM mRNA上甲基化位点进行预测,并结合Maz F-q PCR确定了三种植物化学物作用于IL-6和ICAM mRNA GGACA基序的甲基化,并降低IL-6、ICAM mRNAm6ACA甲基化水平。抑制FTO活性后,发现三种植物化学物对IL-6、ICAM mRNA m6ACA水平的降低作用被逆转,表明三种植物化学物通过靶向FTO作用于IL-6、ICAM mRNA GGACA基序,降低炎症因子IL-6和ICAM mRNA m6ACA修饰水平。此外,利用放线菌素D测定了抑制/不抑制FTO活性,三种植物化学物对IL-6和ICAM mRNA的稳定性的影响。结果表明,所选植物化学物显著降低了IL-6、ICAM mRNA的稳定性,当抑制FTO活性后,发现三种植物化学物对IL-6和ICAM mRNA稳定性的降低作用也被逆转,表明三种化合物靶向FTO下调IL-6和ICAM mRNA的稳定性。综上所述,三种植物化学物基于FTO介导的m6A修饰抗肠道炎症的作用机制为:直接激活FTO活性,靶向炎症因子IL-6、ICAM mRNA GGACA位点的甲基化修饰,降低IL-6、ICAM mRNA m6ACA甲基化修饰水平,从而降低IL-6、ICAM mRNA的稳定性,进一步抑制其转录和翻译,发挥抗炎作用。