关键词：
甘油磷脂
LC-MS/MS
样品预处理
液-液萃取
摘要：
目的:为了可以准确检测人血浆中甘油磷脂类物质,采用LC-MS/MS技术,开展血浆样品前处理优化工作,最终建立一个重复性好,回收率高,且成本相对比较低的甘油磷脂检测方法。采用该方法对甘油磷脂类物质进行检测,主要包括:磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)和溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)。方法:(1)质谱条件优化:通过质谱直接进样技术,采用标准品对每类磷脂的质谱条件进行优化。(2)色谱条件优化:通过LC-MS/MS技术,采用标准品对流动相种类、洗脱梯度等色谱条件进行优化。(3)样品预处理方法优化:通过LC-MS/MS技术,采用标准品及血浆样品优化预处理过程中的各项步骤以确定最佳的预处理方法。具体步骤包括:去蛋白溶剂的选择,萃取溶剂的选择,萃取次数的选择,复溶溶剂及比例的选择,复溶溶剂p H的选择。(4)方法学验证:对本研究所建立的方法的回收率,基质效应,线性范围,检测限,定量限,日内及日间精密度进行考察。结果:(1)本研究采用各类磷脂化合物的标准品,通过质谱直接进样技术和LC-MS/MS技术得到各物质的MRM条件,其中包括每种物质的母离子/子离子离子对、CE、DP、CEP、EP、CXP值等。(2)从去蛋白效果来看,乙腈的去蛋白效果较好,最终选用乙腈为本研究的去蛋白溶剂。通过比较不同溶剂的萃取效果,从二氯甲烷-甲醇(2:1,V/V)与氯仿-甲醇(2:1,V/V)萃取PE,PC,LPC效果的综合考虑,选用氯仿-甲醇(2:1,V/V)作为最终的萃取溶剂,并且对比萃取溶剂萃取一次及两次的各物质信号响应强度,选择萃取两次作为最终萃取次数。(3)从各磷脂化合物的信号响应强度的高低、峰形的好坏及其在酸碱性不同的环境中的稳定性来看,选择甲醇-异丙醇(9:1,V/V,0.1%FA)作为最适合的复溶溶剂。(4)三种磷脂化合物LPC、PC、PE的标准曲线线性范围均为5-1000 ng/m L。通过对本研究所建立方法的回收率的考察,3种物质在低、中、高3个浓度的回收率分别为53.78%-55.04%,80.87%-93.90%,92.60%-103.0%,其CV为0.38%-7.74%。日内精密度变化小于7.12%,变异系数在2.26%-7.12%之间,日间精密度变化小于9.82%,变异系数在0.61%-9.82%之间。结论:本研究建立了基于LC-MS/MS技术检测甘油磷脂类物质LPC、PC、PE的方法。结果表明,该方法简单,未采用复杂的预处理手段,灵敏度高,便于检测血浆中的LPC、PC、PE。该实验适合用于医学实验室的检测。此外,很多代谢性疾病如糖尿病、高血压及动脉粥样硬化等的发生发展都与这三类磷脂的异常代谢明显相关,本研究所建立的方法可为某些代谢性疾病的研究提供技术支持。
