关键词:
柑橘
游离氨基酸
衍生
气相色谱
固相微萃取
液-液萃取
摘要:
氨基酸是蛋白质的基本组成单位,在能量代谢、神经传递和脂质转运中起着至关重要的作用。柑橘具有很高的营养价值,其中游离氨基酸种类丰富,含量较高。柑橘品种繁多,分析测定不同产地、不同品种以及不同生长期和贮藏条件下游离氨基酸的种类与含量,可以为人体合理摄入氨基酸及柑橘的加工利用提供依据。因此,研究操作简单和灵敏度高以及低成本的果蔬游离氨基酸检测方法是有必要的。气相色谱(gas chromatography,GC)法分析氨基酸,具有衍生物稳定、分辨率高、操作简便、运行成本低、分析时间短等优点,同时结合具有集萃取、分离、浓缩和进样于一体的固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技术可以提高检测的灵敏度和简化操作步骤以及降低检测成本。本文以氯甲酸异丁酯(isobutyl chloroformate,IBCF)为衍生试剂,溶胶-凝胶甲基丙烯酸丁酯-二乙烯基苯(butyl methacrylate-divinylbenzene,BMA-DVB)为萃取头,采用液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)和直接固相微萃取(direct immersion solid phase microextraction,DI-SPME)技术,针对柑橘果肉中游离氨基酸,建立了氯甲酸异丁酯二次衍生-气相色谱检测方法、氯甲酸异丁酯衍生直接固相微萃取-气相色谱检测方法和液-液萃取/直接固相微萃取-气相色谱检测方法。主要研究内容和结果如下:(1)氯甲酸异丁酯二次衍生-气相色谱法检测柑橘中游离氨基酸的方法研究对二次衍生条件和超声提取条件进行优化,结果显示吡啶、异丁醇、第1次IBCF和第2次IBCF的加入量分别是20 μL、120 μL、50 μL和50 μL,萃取溶剂为二氯甲烷时,可以达到最佳的衍生量;按照1:50的料液比,270W超声功率下分两步提取可以达到最大的提取量。同时,氨基酸衍生物可以在-18℃下24 h内保持稳定,衍生转化率与茚三酮-紫外分光光度法的转化率无差异。在最优条件下,采用外标法进行定量分析,18种氨基酸在其对应范围内线性关系良好,决定系数 R2 均大于 0.99,检测限(limit of detection,LOD)在 0.02~0.35 μg/mL之间,定量限(limit of quantification,LOQ)为 0.07~1.16 μg/mL,5 次重复试验相对标准偏差(relative standard deviation,RSD%)不超过10.57%,加标回收率均在72.82%~132.97%之间。该方法简便、准确、重现性好、成本低,衍生物稳定,可以用于柑橘果肉中18种游离氨基酸的检测。(2)柑橘果肉中游离氨基酸的氯甲酸异丁酯衍生直接固相微萃取-气相色谱检测方法研究优化了超声提取、衍生、氮吹时间和DI-SPME条件,优化结果为:去离子水为萃取溶剂,料液比1:2,超声功率240 W,超声时间20 min;衍生pH=9,吡啶加入量80 μL,异丁醇加入量340 μL,IBCF加入量100μL;氮吹时间20 min;DI-SPME萃取温度70℃,萃取时间50 min,无水Na2SO4加入量10%,萃取pH=2.30,搅拌速度800 r/min。在最优条件下,建立了氯甲酸异丁酯衍生直接固相微萃取-气相色谱检测方法,15种氨基酸在线性范围内线性关系较好,除苯丙氨酸外其余的决定系数R2均大于0.99。LOD为0.36~25.17 μg/kg,LOQ为0.52~83.89 μg/kg,5次重复试验的RSD%在5.40%~12.88%之间,加标回收率在66.3%~126.12%之间,RSD%≤15.05%,说明该方法的灵敏度高、重现性好,能够满足检测需求。(3)液-液萃取/直接固相微萃取-气相色谱法检测柑橘果肉中游离氨基酸的方法研究对衍生时间、LLE和DI-SPME条件进行优化。得到的最佳条件:涡旋衍生时间1 min;二氯甲烷加入量2mL,涡旋萃取时间1 min;DI-SPME萃取温度60℃,萃取时间30 min,无水Na2SO4加入量30%,不调节pH,搅拌速度 1000 r/min。最优条件下,建立了 LLE/DI-SPME-GC方法,15种氨基酸在线性范围内线性关系较好,决定系数R2均大于0.99。LOD为0.85~12.60 μg/kg,LOQ为2.82~41.99μg/kg,灵敏度高,5次重复试验的重现性RSD%介于3.53%~12.80%之间。加标回收率在70.86%~127.98%之间,RSD%≤15.51%。将该方法进行真实样品的检测,并与前面2种方法进行结果对比;将本文建立的3种检测方法及其与文献方法进行比较,结果显示3种方法准确可靠。